一、样品制备
1蛋白质的溶解：样品中蛋白质的溶解程度对分离效果有显著影响。如果蛋白质溶解不完全，会导致在等电聚焦时部分蛋白质沉底，从而减少转移到第二向电泳的蛋白质数量。
2.还原处理：使用还原剂处理样品时，应及时加入巯基保护剂，以避免二硫键重新形成，导致斑点减少或出现假斑点。
3.纯化处理：样品中的脂类、多糖、核酸、盐、有机物小分子等杂质会干扰双向电泳的结果，应适当进行纯化处理。
二、电泳介质与缓冲液
1.电泳介质：不同的电泳介质对电泳的分离效果有重要影响。例如，聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳的分离效果可能不同。琼脂糖凝胶的孔径较大，适合分离大分子蛋白。
2.缓冲液pH值与离子强度：缓冲液的pH值会影响蛋白质的解离程度和带电性质，从而影响电泳速度和方向。离子强度过低会影响缓冲能力，过高则会在待分离分子周围形成离子氛，降低电泳速度。
三、电场强度与电泳时间
1.电场强度：电场强度越大，电泳速度越快。但增大电场强度会引起介质温度升高，可能导致样品和缓冲离子扩散速度增加，影响分离效果。因此，需要选择适当的电场强度。
2.电泳时间：电泳时间的长短也会影响分离效果。通常情况下，电泳时间越长，分离效果越好。但过长的电泳时间可能导致样品扩散增加，影响分离带的清晰度。
四、支持介质与筛孔大小
1.支持介质：支持介质的性质对电泳分离效果有重要影响。例如，滤纸、琼脂糖、玻璃等表面可能存在的带电基团会影响电渗现象，从而影响电泳速度。
2.筛孔大小：支持介质的筛孔大小对待分离生物大分子的电泳迁移速度有明显影响。筛孔大的介质中泳动速度快，反之则慢。
五、其他因素
1.温度：温度的变化会影响电泳的速度和分离效果。一般来说，在较低的温度下进行电泳可以获得较好的分离效果。
2.电极形状与材料：电极的形状和材料也会影响电泳的速度和分离效果。例如，不同形状的电极可能产生不同的电场分布，从而影响电泳分离带的形状和位置。
3.凝胶制备与更新：凝胶的制备过程中应避免气泡的产生，以免影响电泳结果。同时，为保持电泳所需的离子强度和pH值稳定性，应经常更新电泳缓冲液。
