一、材料与仪器准备
1.脐带血来源的MNCs（CB-MNCs）：作为非限制性体干细胞的来源。
2.灭菌起始培养基：用于细胞初始培养。
3.扩增培养基：用于细胞扩增培养。
4.0.05%的胰蛋白酶：用于细胞消化传代。
5.含EDTA的PBS：用于细胞清洗和分离。
6.T25培养瓶：用于细胞培养。
7.其他常规细胞培养设备：如CO2培养箱、离心机等。
二、分离步骤
1.制备和分离脐带血来源的MNCs（CB-MNCs）：
如果使用新鲜采集的脐带血，需要对其进行处理以分离出MNCs。
如果使用冻存的CB-MNCs，则复苏细胞后可直接用于培养，无需额外分离步骤。
2.细胞接种与培养：
将分离得到的CB-MNCs按5×106~7×106个细胞/mL的浓度接种到T25培养瓶中。
将培养瓶置于37℃、5%CO2的条件下进行培养。
3.培养基更换与细胞观察：
在培养后的2~4周内，每周更换一次培养基和细胞因子，以维持细胞的生长和活性。
定期观察细胞生长情况，注意有无污染和细胞形态变化。
4.USSC集落形成与扩增：
当形成明显的USSC集落后，将细胞转移到扩增培养基中进行扩增培养。
继续在37℃、5%CO2的条件下培养细胞，直至达到所需的细胞数量。
5.细胞传代：
当细胞达到80%汇合时，用0.05%胰蛋白酶/EDTA消化细胞。
按1:3的比例将细胞传代到新的培养瓶中，继续在相同条件下培养。
三、注意事项
1.无菌操作：整个分离和培养过程需要在无菌条件下进行，以避免细胞污染。
2.细胞活性监测：定期观察细胞形态和生长情况，确保细胞保持良好的活性。
3.培养基选择：根据细胞类型和实验需求选择合适的培养基和细胞因子。
