一、技术原理
ELISPOT技术基于免疫细胞受刺激分泌细胞因子后，通过特异性抗体捕获与显色反应，在PVDF膜上形成可计量的斑点，从而实现对细胞因子分泌的定性与定量分析。
其核心流程包含以下关键环节：
1.细胞激活：当免疫细胞（如T细胞、B细胞）接触抗原或丝裂原等刺激物时，其表面受体识别刺激信号并激活细胞内信号通路，启动特定细胞因子（如IFN-γ、IL-4）的合成与分泌。
2.捕获标记：分泌的细胞因子通过胞吐作用释放到细胞外微环境中，形成局部高浓度区域。ELISPOT板的PVDF膜表面预先包被针对目标细胞因子的单克隆抗体。细胞分泌的因子扩散至膜表面时，与抗体发生高亲和力结合，形成抗原-抗体复合物。未被结合的细胞因子则通过洗涤步骤清除，确保检测的特异性。
3.显色反应：加入生物素标记的二抗，该抗体针对同一细胞因子的不同表位，与已捕获的因子结合形成“三明治”复合物。随后添加链霉亲和素-酶（如碱性磷酸酶）偶联物，利用生物素与亲和素的高强度结合特性，将酶固定在反应位点。在酶催化作用下，底物（如BCIP/NBT）发生氧化还原反应，生成不溶性有色沉淀物（如NBT还原为紫色甲臜）。
4.分析：每个活性分泌细胞在膜表面形成单个斑点，其直径与细胞分泌的因子总量正相关，斑点轮廓清晰度由细胞活性和分泌速率决定。专用ELISPOT分析仪通过图像识别算法，区分真实斑点与背景噪声，统计单位面积内的斑点数量。结合标准曲线或阳性对照，可换算分泌细胞比例及单细胞分泌量，检测灵敏度可达1/100,000细胞级别。
二、实验方法
ELISPOT实验通常包括以下步骤：
1.预包被抗体：将特异性单克隆抗体包被在96孔板的PVDF膜上，以捕获目标细胞因子。
2.细胞接种：将待检测的细胞悬液加入到孔板中，让细胞在板上培养一定时间。期间，细胞会在刺激下分泌细胞因子。
3.捕捉分泌物：细胞因子一旦被分泌，会被孔板底部的抗体捕获，并固定在孔板上。
4.检测抗体：加入与被捕获因子特异结合的二抗（通常是与酶结合的抗体），用以检测捕获的细胞因子。
5.显色反应：通过加入底物，酶催化反应会生成可见的色斑（spot），每个斑点代表一个分泌目标因子的单细胞。
6.计数与分析：用专用的ELISPOT读板仪计数斑点，从而推断每孔中分泌某种因子的细胞数量。
三、实验注意事项
1.无菌操作：整个实验过程需要在无菌条件下进行，以避免细胞污染。
2.细胞活性：确保待检测的细胞保持较高的活性，以获得准确的实验结果。
3.抗体选择：选择高亲和力、高特异性的抗体，以提高检测的灵敏度和特异性。
4.洗涤步骤：洗涤步骤要彻底，以去除未结合的细胞因子和抗体，减少背景噪声。
5.显色时间：显色时间要适当，过长或过短都会影响斑点的形成和计数。
四、应用领域
ELISPOT技术被广泛应用于免疫学研究，尤其是在疫苗研发、感染性疾病研究、自身免疫疾病和癌症免疫治疗等领域。通过ELISPOT技术，研究者可以高效筛选出针对疾病或病原体有应答的细胞群体，从而帮助开发更有针对性的治疗方法和疫苗。
