一、准备工作
1.开启荧光显微镜：
打开荧光显微镜的电源，预热灯源（如汞灯或LED灯）15~30分钟，确保光源稳定。
2.放置样本：
将染色后的细胞样本放置在显微镜的载物台上，用压片夹固定，确保样本平稳且位置适中。
二、光路调节（以汞灯为例）
1.选择激发滤片：
根据荧光染料的激发波长，选择合适的激发滤片。例如，若使用FITC（异硫氰酸荧光素）染色，其最大激发波长为490~495nm，应选用BP490激发滤片。
2.光路对准：
转动滤光片转轮，将激发滤片置于光路中。
通过目镜观察，调节聚光镜和光圈，使视野亮度均匀，无明显的光斑或阴影。
三、聚焦与观察
1.低倍镜聚焦：
先用低倍物镜（如10×）对样本进行聚焦，找到细胞的大致位置。
调节粗准焦螺旋，使物镜接近样本，然后慢慢上升，直到看到模糊的细胞图像。
再调节细准焦螺旋，使图像清晰。
2.转换高倍镜：
找到感兴趣的细胞区域后，转换到高倍物镜（如40×或100×，需配合油镜使用）进行观察。
转换高倍镜前，应确保样本已用浸油（如香柏油）覆盖，以避免光线折射影响观察效果。
3.调节视野亮度：
根据需要调节视野亮度，避免过亮或过暗。过亮可能导致荧光淬灭，过暗则可能无法清晰观察荧光信号。
四、荧光观察与记录
1.观察荧光信号：
在荧光模式下，观察细胞发出的荧光信号。荧光信号通常呈现为特定颜色的亮点或区域，与染色剂的特性有关。
注意区分特异性荧光信号和非特异性荧光信号（如背景荧光）。
2.拍照记录：
使用显微镜配备的相机或连接计算机进行拍照记录。
拍照时，应确保曝光时间、增益等参数设置合适，以获得清晰、准确的荧光图像。
五、注意事项
1.避免荧光淬灭：
荧光染料在强光下容易淬灭，因此观察时应尽量缩短曝光时间，避免长时间照射。
拍照后，应及时关闭光源或转换到明场模式，以减少荧光淬灭。
2.保持样本湿润：
观察过程中，应保持样本湿润，避免样本干燥导致细胞变形或荧光信号减弱。
3.防止污染：
操作过程中，应注意防止样本污染。使用清洁的载玻片、盖玻片和染色剂，避免交叉污染。
