一、染色原理
吖啶橙是一种荧光染料，其激发峰为492nm，荧光发射峰分别为530nm（DNA）和640nm（RNA）。吖啶橙与双链DNA的结合方式是嵌入双链之间，而与单链DNA和RNA则由静电吸引堆积在其磷酸根上。在蓝光（约502nm）激发下，细胞核中的DNA会发出亮绿色荧光（约530nm），而核仁和胞质中的RNA则发出橘红色荧光（>580nm）。
二、实验材料
1.原代细胞：如盖片单层培养的原代细胞。
2.固定剂：95%乙醇或乙酸/甲醇（现配）。
3.吖啶橙染液：用生理盐水配成1%的干液，使用时再用PBS稀释成1×10-4至2×10-4 mol/L，pH4.5至5.0的染色液。
4.其他试剂：0.1mol/L的CaCl2、1%乙酸等。
三、染色步骤
1.细胞准备：将盖片单层培养的原代细胞从瓶中取出，立即用温Hanks液漂洗3至5秒，以去除培养基中的血清。
2.细胞固定：将细胞投入95%乙醇或乙酸/甲醇中固定15至30分钟，然后用滤纸接触盖片边缘，使盖片微干。
3.酸化处理：用1%乙酸酸化细胞30秒。
4.吖啶橙染色：用1×10-4至2×10-4的吖啶橙染液染色细胞30秒或1分钟。
5.氯化钙处理：用0.1mol/L的CaCl2处理细胞30秒至2分钟。
6.漂洗：用PBS漂洗细胞3次，每次数秒。
7.观察：将处理好的细胞标本置于荧光显微镜下观察。在蓝光激发下，细胞核中的DNA呈亮绿色荧光，核仁和胞质中的RNA呈橘红色荧光。
四、注意事项
1.操作规范：在整个染色过程中，应严格遵守实验室操作规范，避免污染和交叉污染。
2.观察条件：在荧光显微镜下观察时，应选择合适的激发滤片和发射滤片，以获得清晰的荧光图像。
3.标本保存：处理好的细胞标本可以保存在95%乙醇中数日，如退色可再用AO染色。
4.细胞状态：吖啶橙对活原代细胞毒性小，但固定染色观察法效果更好。因此，在实际操作中可以根据需要选择直接染色活细胞或固定后染色。
五、应用与意义
吖啶橙荧光染色法简便快捷，既可染活原代细胞又可染固定原代细胞。该方法能够清晰地显示原代细胞中的DNA和RNA分布，对于研究细胞的生理状态、病理变化以及基因表达等方面具有重要意义。
