一、实验材料
1.饲养层细胞：如脐带血来源的间充质干细胞（CB-MSCs）。
2.培养基：
MSCs培养基：用于饲养层细胞的培养。
共培养培养基：IMDM添加10%FBS，100U/ml青霉素和100μl/ml链霉素。
细胞因子：包括干细胞因子、IL-6、Flt-3配体、促血小板生成素等，用于促进CD34+细胞的增殖。
其他试剂：丝裂霉素C（用于处理饲养层细胞，抑制其增殖能力）等。
二、实验步骤
1.饲养层细胞的准备：
将CB-MSCs用MSCs培养基重悬，调整细胞浓度为5×10^4个细胞/ml。
将CB-MSCs接种到6孔培养板中，每周两次半量更换新鲜培养基。
当CB-MSCs达到90%以上汇合时，用10μg/ml丝裂霉素C处理，37℃孵育2.5小时，以抑制其增殖能力。
用无血清IMDM将处理后的CB-MSCs洗两遍，去除丝裂霉素C。
2.CD34+细胞的接种与培养：
按1×10^4/ml的浓度将CD34+细胞重悬于含细胞因子的共培养培养基中。
将CD34+细胞接种到处理后的CB-MSCs饲养层细胞上。
每周两次更换1/4培养基，以补充消耗的营养物质和细胞因子。
3.细胞的收集：
在共培养2周后，收集未贴壁的CD34+细胞。
可以通过流式细胞术等方法检测细胞的增殖情况和纯度。
三、实验要点
1.饲养层细胞的选择：饲养层细胞应具有良好的增殖能力和分泌细胞因子的能力，以支持CD34+细胞的增殖。除了CB-MSCs外，骨髓基质细胞、皮肤成纤维细胞等也可以作为饲养层细胞使用。
2.细胞因子的作用：细胞因子在促进CD34+细胞增殖中起着关键作用。不同的细胞因子组合和浓度对细胞的增殖效果有所不同，需要根据实验目的进行优化。
3.无菌操作：整个实验过程需要在无菌条件下进行，以防止细胞污染。
四、实验优势
1.高效扩增：饲养层细胞共培养可以显著提高CD34+细胞的扩增效率，满足临床和科研对大量细胞的需求。
2.保持细胞特性：共培养体系可以较好地保持CD34+细胞的干细胞特性，为后续的实验和应用提供高质量的细胞来源。
五、注意事项
1.饲养层细胞的处理：丝裂霉素C处理饲养层细胞的时间和浓度需要严格控制，以避免对饲养层细胞的过度损伤。
2.细胞因子的稳定性：细胞因子在培养基中的稳定性需要关注，可以通过添加保护剂或优化培养基配方来提高其稳定性。
3.细胞的收集与检测：在收集细胞时需要注意避免细胞损伤和污染。同时，需要对收集到的细胞进行纯度、活性等方面的检测，以确保其质量。
