细胞计数和活力测定实验方法
细胞计数和活力测定是细胞生物学和生物医学研究中的基础实验，用于评估细胞的数量和存活状态。以下是常用的实验方法：
一、实验原理
1.细胞计数
通过显微镜直接计数或使用自动化细胞计数器，统计单位体积内的细胞数量。
常用方法：血细胞计数板法、流式细胞术、自动细胞计数仪。
2.细胞活力测定
基于活细胞和死细胞对染料的吸收差异，区分存活与死亡细胞。
常用染料：台盼蓝（Trypan Blue）、碘化丙啶（PI）、钙黄绿素-AM（Calcein-AM）。
二、实验材料与仪器
1.材料
细胞悬液（待测样本）
0.4% 台盼蓝溶液（或其他活力染料）
PBS缓冲液（用于稀释和洗涤）
2.仪器
血细胞计数板（或自动细胞计数仪）
倒置显微镜
移液器及枪头
离心机
流式细胞仪（可选）
三、实验步骤
1. 血细胞计数板法
（1）细胞悬液制备
收集细胞，1000 rpm离心5分钟，弃上清。
用适量PBS重悬细胞，调整至适当浓度（如1×10⁵~1×10⁶/mL）。
（2）染色（可选）
取100 μL细胞悬液，加入100 μL 0.4%台盼蓝溶液，混匀后室温孵育5分钟。
活细胞不吸收台盼蓝，死细胞被染成蓝色。
（3）计数板加样
将计数板盖玻片盖于计数室上。
取10 μL染色后的细胞悬液，沿盖玻片边缘缓慢加入，避免气泡。
（4）显微镜计数
10×物镜下观察，计数四个大方格（每个1 mm²）中的细胞数。
计算公式：
细胞浓度（/mL）=4四个大方格细胞总数×104×稀释倍数
活力计算：
细胞活力（%）=总细胞数活细胞数×100%
2. 自动细胞计数仪法
操作步骤：
按仪器说明书准备细胞悬液（通常需稀释至特定浓度范围）。
取10~20 μL细胞悬液加入计数芯片或专用计数板。
插入仪器，运行程序自动计数并计算活力。
优势：快速、准确，减少人为误差。
3. 流式细胞术（可选）
操作步骤：
细胞悬液与荧光染料（如PI）孵育，标记死细胞。
流式细胞仪检测荧光信号，区分活细胞（无荧光）和死细胞（有荧光）。
软件分析细胞浓度和活力。
优势：高通量，可同时进行多参数分析。
四、注意事项
1.细胞悬液均匀性
充分混匀细胞悬液，避免细胞沉降导致计数偏差。
2.染色时间控制
台盼蓝染色时间不宜过长，否则可能影响活细胞状态。
3.计数板清洁
使用前后彻底清洗计数板，避免残留细胞或染料干扰结果。
4.重复实验
至少进行三次独立计数，取平均值以提高准确性。
五、结果示例
|
实验方法 |
细胞浓度（/mL） |
细胞活力（%） |
|
血细胞计数板法 |
8.5×10⁵ |
92% |
|
自动计数仪法 |
8.7×10⁵ |
93% |
|
流式细胞术 |
8.6×10⁵ |
91% |
六、常见问题与解决方案
1.细胞团块干扰计数
解决方案：用移液器轻轻吹打细胞悬液，或过滤（如40 μm滤网）去除团块。
2.染色过深或过浅
解决方案：调整台盼蓝浓度或染色时间，优化细胞与染料比例。
3.计数板气泡
解决方案：加样时沿盖玻片边缘缓慢注入，避免产生气泡。
七、总结
1.血细胞计数板法：适合实验室常规操作，成本低，但依赖经验。
2.自动细胞计数仪法：快速准确，适合高通量需求。
3.流式细胞术：功能强大，可结合多参数分析，但设备昂贵。
