一、检测原理
过氧化物酶（POD）是一种含血红素的氧化酶，广泛存在于各种动物、植物和微生物体内。它能够催化由过氧化氢（H₂O₂）参与的多种氧化反应，生成具有特征吸收峰的产物。例如，POD可催化H₂O₂氧化愈创木酚生成茶褐色的4-邻甲氧基苯酚，该产物在470nm处有特征吸收峰。通过测定该波长下的吸光值变化，即可表征过氧化物酶的活性。
二、试剂与器材
1.试剂
过氧化物储存液：如30mmol/L过氧化氢储存在T-牛血清白蛋白（Tris-牛血清白蛋白溶液）中。
样品缓冲液：如2体积的T-牛血清白蛋白溶液+1体积的2%（体积分数）Triton X-100。
钛氧硫化物（2.25g/L）溶于1mol/L硫酸中。
T-牛血清白蛋白：20mmol/L的Tris-HCl（pH7.0），含1g/L牛血清白蛋白。
提取液：用于提取细胞中的过氧化物酶。
试剂一、试剂二、试剂三：根据具体试剂盒说明书配制。
2.器材
微量离心机，带2.0ml微量离心管。
分光光度计：用于测定吸光值。
96孔板或玻璃比色皿：用于反应和测定。
研钵/匀浆器：用于组织样本的匀浆处理。
可调式移液器：用于准确移取试剂。
台式离心机：用于样本的离心处理。
恒温水浴锅/培养箱：用于控制反应温度。
三、实验步骤
1.样本制备
对于组织样本，称取适量样本，加入提取液进行冰浴匀浆，离心后取上清置于冰上待测。
对于细菌/细胞样本，先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；加入提取液进行超声波破碎，再次离心后取上清置于冰上待测。
对于液体样本，如血清或培养液，可直接检测或适当稀释后再进行检测。
2.试剂预热与混合
分光光度计预热30min以上，调节波长至470nm。
试验前将试剂一、试剂二和试剂三预热至指定温度（如37℃或25℃）。
在96孔板或玻璃比色皿中按顺序加入试剂和样本，迅速混匀并计时。
3.吸光值测定
记录反应开始时的吸光值A1和反应一段时间后的吸光值A2（如30s和90s）。
计算ΔA=A2-A1，用于表征过氧化物酶的活性。
4.结果计算
根据试剂盒说明书提供的公式计算过氧化物酶的活性单位。例如，可按组织蛋白浓度、组织样本质量、细菌或细胞数量或液体样本体积进行计算。
四、注意事项
1.样本处理：样本处理过程中要保持低温环境，以避免酶活性丧失。
2.试剂配制：试剂配制要准确，避免浓度过高或过低影响实验结果。
3.反应条件：反应温度、时间和pH值等条件要严格控制，以确保实验结果的准确性。
4.仪器校准：分光光度计等仪器要定期校准，以确保测定结果的可靠性。
5.设立对照：实验过程中要设立阳性和阴性对照，以验证实验结果的准确性。
