1. 磁珠法
步骤:
1.加入一定量(如200μl)的血液标本。
2.加入Proteinase K溶液和裂解液,振荡混匀。
3.将离心管置于一定温度(如65℃)孵育一段时间(如15分钟),期间颠倒混匀数次。
4.室温放置一段时间后,加入异丙醇振荡混匀。
5.加入磁珠悬浮液,振荡混匀并静置,使磁珠充分吸附DNA。
6.将离心管放置于磁力架上静置,磁珠完全吸附后,小心吸去液体。
7.加入洗涤液洗涤磁珠,去除杂质。
8.加入洗脱液,将DNA从磁珠上洗脱下来。
特点:磁珠法可以进行自动化的提取,省去了大量的人工操作,省时又省力,适合处理样本量较大的情况。
2. 离心柱法
步骤(以某品牌试剂盒为例):
1.取一定量(如200μl)的新鲜、冷冻或加入各种抗凝剂的血液,放入离心管。
2.加入缓冲液,充分混匀,室温放置一段时间。
3.加入结合液,立刻涡旋振荡充分混匀。
4.加入异丙醇,涡旋振荡充分混匀。
5.将混合物加入吸附柱中,离心,倒掉收集管中的废液。
6.加入抑制物去除液,离心,弃废液。
7.加入漂洗液,离心,弃废液,重复洗涤一次。
8.将吸附柱放回空收集管中,离心,尽量除去漂洗液。
9.取出吸附柱,放入干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加入洗脱缓冲液,室温放置一段时间后离心,将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,室温放置后再次离心,收集DNA溶液。
特点:离心柱法的提取纯度高一些,但样本处理方法比较繁琐,全程需人工操作,耗时长。
3. 酚-氯仿法
步骤:
1.加入红细胞裂解液去除红细胞。
2.加入细胞裂解液、蛋白酶K,混匀,置于一定温度(如50℃)水浴一段时间(如3小时)。
3.将消化好的液体移入离心管中,加入等体积饱和酚,混匀,离心。
4.吸取上清转入另一离心管中,加入等体积的酚氯仿,混匀,离心。
5.将上清液转入另一离心管中,加入醋酸钠和异丙醇(或乙醇),混匀,置于低温冰箱中一段时间(如3小时)。
6.离心,弃去上清。
7.加入乙醇,温和摇晃,离心,弃去上清,重复洗涤一次。
8.将洗涤好的DNA置于超净工作台干燥。
9.加入TE或去离子水溶解沉淀DNA,置于低温保存。
特点:酚-氯仿法抽提DNA的原理是通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质,再加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。其优点是不限制初始样本量,缺点是其试剂对人体有毒害作用,且操作繁琐,耗时很长,因此基本被现在的试剂盒方法取代。
4. 试剂盒法
步骤:
1.在离心管底部加入蛋白酶K和一定量(如200μl)的全血样本。
2.加入Buffer AL,旋涡震荡混匀。
3.一定温度(如56℃)水浴一段时间(如10分钟)。
4.短暂离心收集离心管盖上的液体。
5.添加无水乙醇,旋涡震荡混匀,短暂离心收集离心管盖上的液体。
6.过吸附柱,离心,弃滤液。
7.加入Buffer AW1,离心,弃滤液。
8.加入Buffer AW2,离心,弃滤液。
9.最高速离心。
10.加入洗脱液,室温静置,离心,将DNA洗脱下来。
特点:试剂盒法操作相对简便,提取效率较高,但价格可能较高。不同品牌的试剂盒在操作步骤、提取效率和价格等方面可能存在差异。