一、常见问题及解决方案

1. 细胞污染

问题描述：
细胞污染是细胞培养中最常见的问题，包括细菌、真菌、支原体和交叉污染（不同细胞系之间的污染）。

解决方案：

细菌/真菌污染：

预防：在无菌条件下操作，使用抗生素（如青霉素-链霉素）但避免长期依赖。

处理：一旦发现污染，立即丢弃受污染细胞，彻底清洁培养箱、超净台和所有相关器材。

支原体污染：

检测：定期使用PCR或荧光染色法检测支原体。

处理：使用支原体清除剂（如Mycoplasma Removal Agent）或抗生素（如氟喹诺酮类），但需注意抗生素可能对细胞产生毒性。

交叉污染：

预防：严格区分不同细胞系的培养器材，使用独立的培养箱或分隔区域。

处理：通过STR（短串联重复序列）分析确认细胞系身份，必要时重新获取细胞。

2. 细胞生长缓慢或停滞

问题描述：
细胞增殖速率低于预期，甚至停止生长。

解决方案：

检查培养基：确保培养基新鲜且成分完整（如氨基酸、维生素、生长因子）。

调整血清浓度：血清质量差异显著，尝试更换批次或品牌。

优化培养条件：

温度：确保培养箱温度稳定在37°C（±0.5°C）。

CO₂浓度：维持5% CO₂，避免波动。

pH值：使用含碳酸氢盐缓冲系统的培养基，定期检测pH。

传代密度：避免过度稀疏或密集传代，通常按1:2至1:5的比例传代。

3. 细胞形态异常

问题描述：
细胞出现空泡、颗粒、凋亡或形态不规则。

解决方案：

检查消化过程：胰酶消化时间过长或温度过高会损伤细胞，需优化消化条件。

检测毒性：更换培养基、血清或添加物，排除化学物质毒性。

评估营养缺乏：补充谷氨酰胺、非必需氨基酸等营养成分。

检查支原体污染：支原体感染会导致细胞形态异常。

4. 细胞凋亡或死亡

问题描述：
细胞出现漂浮、碎裂或台盼蓝染色阳性。

解决方案：

优化培养条件：确保培养基pH、温度和渗透压适宜。

减少机械损伤：轻柔操作，避免吹打过度。

检测毒性物质：更换培养基、血清或抗生素，排除毒性影响。

评估细胞密度：避免过度拥挤导致营养耗尽。

 

二、关键注意事项

1. 无菌操作

超净台使用：操作前紫外照射30分钟，操作时关闭紫外灯，避免直接照射细胞。

器材灭菌：所有器材需高压灭菌或75%乙醇消毒，移液器吸头需无菌包装。

个人防护：佩戴手套、口罩和实验服，避免说话或咳嗽污染培养物。

2. 培养基与试剂管理

培养基储存：4°C避光保存，开封后尽快使用，避免反复冻融。

血清处理：分装后-20°C保存，避免反复冻融，使用前56°C灭活30分钟（如需）。

胰酶消化：控制消化时间（通常1-3分钟），避免过度消化。

3. 细胞传代与冻存

传代密度：根据细胞类型调整传代密度，避免过度稀疏或密集。

冻存流程：

使用含10% DMSO的冻存液，逐步降温（4°C 30分钟 → -20°C 1小时 → -80°C过夜 → 液氮长期保存）。

冻存细胞需快速复苏，避免冰晶形成。

4. 细胞计数与活力检测

台盼蓝染色：活细胞拒染，死细胞被染成蓝色，计算活细胞比例。

细胞计数板：确保计数区域无气泡，准确计数四个大方格内的细胞数。

 

三、高级问题与解决方案

1. 细胞分化异常

问题描述：
干细胞或祖细胞分化方向偏离预期。

解决方案：

优化诱导条件：调整生长因子、细胞因子或小分子化合物的浓度和组合。

检测信号通路：通过Western Blot或qPCR检测关键信号通路活性。

2. 细胞克隆形成率低

问题描述：
单细胞克隆形成能力弱。

解决方案：

优化接种密度：确保单细胞分散均匀，避免细胞聚集。

添加条件培养基：使用含特定生长因子或基质的培养基促进克隆形成。

3. 细胞转染效率低

问题描述：
外源基因或siRNA转染效果不佳。

解决方案：

选择合适转染试剂：根据细胞类型选择脂质体、电穿孔或病毒载体。

优化转染条件：调整DNA/RNA浓度、转染试剂用量和转染时间。

 

四、总结与建议

1.严格无菌操作：无菌是细胞培养的基础，任何污染都可能导致实验失败。

2.定期检测与记录：建立细胞培养日志，记录传代时间、细胞状态和培养基更换情况。

3.优化培养条件：根据细胞类型调整培养基成分、温度和CO₂浓度。

4.快速响应问题：一旦发现细胞异常，立即采取措施（如更换培养基、检测污染）。