一、常见蛋白质沉淀方法
1. 盐析法（盐溶与盐析）
原理：
高浓度盐离子（如硫酸铵、氯化钠）可中和蛋白质表面的电荷，降低蛋白质间的静电排斥力，使其溶解度下降而沉淀。
盐溶：低浓度盐可破坏蛋白质周围的水化层，增加溶解度。
盐析：高浓度盐则通过“盐析效应”使蛋白质沉淀。
应用：
常用于初步分离，如硫酸铵分级沉淀可分离不同溶解度的蛋白质。
2. 有机溶剂沉淀法
原理：
有机溶剂（如乙醇、丙酮）可降低水的介电常数，减弱蛋白质与水的相互作用，同时破坏水化层，导致蛋白质沉淀。
应用：
适用于大规模纯化，如乙醇沉淀法常用于DNA和蛋白质的提取。
3. 等电点沉淀法
原理：
蛋白质在其等电点（pI）时净电荷为零，溶解度最低，易沉淀。
应用：
结合其他方法（如盐析）可提高选择性，如分离血清蛋白时调整pH至目标蛋白的pI。
4. 选择性沉淀法
原理：
利用特定试剂与蛋白质结合形成不溶性复合物，如重金属盐（AgNO₃、HgCl₂）与蛋白质巯基结合。
应用：
用于检测或去除特定蛋白质，但需注意毒性问题。
5. 聚合物沉淀法
原理：
非离子型聚合物（如聚乙二醇PEG）通过空间位阻效应排斥蛋白质周围的水分子，降低溶解度。
应用：
常用于浓缩蛋白质溶液，如PEG沉淀法可高效回收酶类。
6. 免疫沉淀法
原理：
利用抗体与目标蛋白特异性结合，形成免疫复合物后沉淀。
应用：
用于富集低丰度蛋白或研究蛋白质相互作用。
二、常见沉淀剂及其特性
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沉淀剂类型 |
代表试剂 |
作用机制 |
应用场景 |
注意事项 |
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中性盐 |
硫酸铵、氯化钠 |
中和电荷，破坏水化层 |
初步分离、分级沉淀 |
高浓度盐可能影响蛋白质活性，需透析去除 |
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有机溶剂 |
乙醇、丙酮 |
降低介电常数，破坏水化层 |
大规模纯化、DNA/蛋白质共沉淀 |
易燃易爆，需在通风环境操作 |
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酸类 |
三氯乙酸（TCA）、高氯酸 |
酸化环境使蛋白质变性并沉淀 |
去除核酸酶、浓缩蛋白 |
强腐蚀性，需戴防护装备 |
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碱类 |
氢氧化钠、氢氧化钾 |
调节pH至蛋白质等电点，降低溶解度 |
特定pH敏感蛋白的沉淀 |
可能导致蛋白质变性，需控制pH范围 |
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重金属盐 |
硝酸银、氯化汞 |
与巯基结合形成沉淀 |
检测巯基蛋白、去除杂质 |
高毒性，需严格处理废弃物 |
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聚合物 |
聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮 |
通过空间位阻效应排斥水分子 |
浓缩蛋白质溶液、提高回收率 |
粘度大，可能影响后续分离步骤 |
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离子型聚合物 |
肝素、硫酸鱼精蛋白 |
与蛋白质电荷相互作用形成复合物 |
分离特定电荷性质的蛋白质 |
可能引入杂质，需后续纯化步骤 |
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有机酸类 |
苦味酸、单宁酸 |
与蛋白质形成不溶性盐或复合物 |
沉淀碱性蛋白、去除多酚类杂质 |
可能影响蛋白质结构，需评估兼容性 |
三、选择沉淀方法的考虑因素
1.蛋白质性质：
溶解度、等电点、稳定性（如热稳定性、pH敏感性）。
是否需要保持活性（如酶类需避免变性）。
2.实验目的：
初步分离（如盐析）或精细纯化（如免疫沉淀）。
是否需要去除特定杂质（如核酸酶）。
3.操作条件：
实验室设备（如离心机容量、温度控制）。
安全要求（如有机溶剂的通风需求）。
4.后续步骤：
沉淀后是否易于复溶或进一步纯化。
是否引入干扰物质（如盐析后的高盐需透析去除）。
四、注意事项与常见问题
1.蛋白质变性：
强酸、强碱、有机溶剂或高温可能导致蛋白质变性，需优化条件（如低温操作、pH缓冲）。
2.沉淀不完全：
可能原因：盐浓度不足、pH未达等电点、有机溶剂比例过低。
解决方案：调整试剂浓度或分步沉淀。
3.非特异性沉淀：
可能原因：杂质与沉淀剂结合。
解决方案：优化沉淀条件或增加预处理步骤（如离心去除颗粒）。
4.沉淀溶解性差：
可能原因：蛋白质聚集或形成不可逆沉淀。
解决方案：添加去垢剂（如Triton X-100）或改变复溶缓冲液。
五、总结与建议
1.方法选择：根据蛋白质特性和实验需求选择合适方法，如初步分离优先盐析，精细纯化采用免疫沉淀。
2.条件优化：通过预实验确定最佳试剂浓度、pH和温度。
3.安全性：操作有机溶剂和重金属盐时需佩戴防护装备，规范处理废弃物。
4.验证与评估：通过SDS-PAGE、BCA定量等方法验证沉淀效果，评估蛋白质活性。
通过合理选择沉淀方法和优化条件，可高效分离和纯化目标蛋白质，为后续研究提供可靠基础。
