一、离心分离的基本原理
1.离心力：
当离心机旋转时，样品中的颗粒（如细胞、蛋白质、核酸等）因惯性作用受到向外的离心力，该力与颗粒的质量、转速和旋转半径相关。
2.公式：
F=m⋅ω2⋅r
其中，F 为离心力，m 为颗粒质量，ω 为角速度，r 为旋转半径。
3.分离机制：
不同颗粒因密度、大小和形状差异，在离心力作用下以不同速度沉降，从而实现分离。
二、高速离心机的类型与特点
1.按转速分类：
低速离心机：<10,000 rpm，用于分离大颗粒（如细胞）。
高速离心机：10,000–30,000 rpm，用于分离细胞器、病毒等。
超速离心机：>30,000 rpm，用于分离蛋白质、核酸等小分子。
2.按用途分类：
制备型离心机：大容量，用于样品分离和纯化。
分析型离心机：高精度，用于测定颗粒性质（如沉降系数）。
三、常用离心分离方法
1. 差速离心法（Differential Centrifugation）
原理：
通过逐步增加离心力，依次分离不同沉降速度的颗粒。
步骤：
低速离心（如1,000 rpm）去除大颗粒（如细胞碎片）。
中速离心（如10,000 rpm）分离细胞器（如线粒体）。
高速离心（如20,000 rpm）分离病毒或微粒。
应用：
细胞匀浆中分离细胞核、线粒体等。
生物制品的初步纯化。
优点：
操作简单，适合批量处理。
缺点：
分辨率较低，可能交叉污染。
2. 密度梯度离心法（Density Gradient Centrifugation）
原理：
利用密度梯度介质（如蔗糖、Percoll），使颗粒在离心过程中按密度分离。
类型：
速率区带离心：颗粒在梯度中移动，形成区带（需高转速）。
等密度离心：颗粒在自身密度处形成区带（需长时间离心）。
应用：
分离脂蛋白（如LDL、HDL）。
纯化病毒和亚细胞组分。
优点：
分辨率高，适合分离密度相近的颗粒。
缺点：
操作复杂，需精确控制梯度。
3. 等速离心法（Isopycnic Centrifugation）
原理：
颗粒在密度梯度中移动至与自身密度相等的区域后停止。
特点：
长时间离心（数小时至数天）。
颗粒按密度精确分离。
应用：
核酸纯化（如CsCl梯度离心分离质粒DNA）。
蛋白质密度分析。
优点：
分离精度高。
缺点：
耗时，需特殊介质。
四、关键参数对分离效果的影响
1.转速（RPM）与离心力（g）：
转速越高，离心力越大，分离速度越快。
需根据颗粒性质选择合适转速（如病毒需20,000 rpm以上）。
2.离心时间：
时间过短，分离不完全；时间过长，可能导致颗粒聚集或变性。
一般差速离心需5–15分钟，密度梯度离心需30分钟–数小时。
3.温度控制：
低温（4℃）可减少热损伤，适合生物样品。
某些应用需室温或高温（如酶活性测定）。
4.转子类型：
固定角转子：适合颗粒沉降，效率高。
水平转子：适合密度梯度离心，减少颗粒聚集。
五、方法选择与优化策略
|
目标颗粒 |
推荐方法 |
关键参数 |
|
细胞碎片 |
差速离心（低速） |
1,000–3,000 rpm，5分钟 |
|
线粒体 |
差速离心（中速） |
10,000–15,000 rpm，10分钟 |
|
病毒 |
密度梯度离心（速率区带） |
20,000–30,000 rpm，30分钟 |
|
脂蛋白 |
密度梯度离心（等密度） |
长时间离心（数小时），蔗糖梯度 |
|
质粒DNA |
等速离心（CsCl梯度） |
60,000 rpm，过夜 |
优化建议：
1.预处理样品：均质化、稀释或添加保护剂（如甘油）。
2.梯度介质选择：根据颗粒密度选择介质（如Percoll用于细胞，CsCl用于核酸）。
3.转子匹配：确保转子容量和类型符合实验需求。
六、常见问题与解决方案
1.颗粒沉降不完全：
原因：转速过低或时间不足。
解决：提高转速或延长离心时间。
2.区带模糊或重叠：
原因：梯度密度不合适或颗粒聚集。
解决：优化梯度介质或添加分散剂。
3.样品变性或失活：
原因：温度过高或离心力过大。
解决：降低温度或调整转速。
七、总结
高速离心机的离心分离方法需根据颗粒性质（密度、大小）、实验目的（分离、纯化、分析）和仪器条件（转速、转子类型）综合选择。
差速离心适合初步分离，密度梯度离心适合精细分离，等速离心适合高精度分析。
优化参数（转速、时间、温度）和预处理样品是确保分离效果的关键。
