准确测定蛋白质浓度是众多实验的关键步骤之一。NanoDrop 分光光度计作为一款广泛应用于实验室的仪器，大家熟知其在核酸浓度检测方面的出色表现，但它同样具备测定蛋白质浓度的强大功能。本文将详细解读如何使用 NanoDrop 测定蛋白浓度，包括其原理、操作流程以及相关注意事项，为科研工作者提供实用的技术指导。

一、NanoDrop 简介及其在蛋白浓度测定中的地位

NanoDrop 分光光度计以其小巧便携、操作简便且所需样品量极少等优点，在分子生物学实验室中占据重要地位。在蛋白浓度测定方面，它为科研人员提供了一种快速、高效的解决方案，尤其是在处理珍贵或少量蛋白样品时，其优势更为凸显。

 

二、蛋白质 A280 直接测量法

（1）适用范围与原理

1.适用蛋白质类型

蛋白质 A280 测量法适用于含有色氨酸（Trp）或酪氨酸（Tyr）残基、半胱氨酸二硫键（Cys - Cys）且在 280nm 处有吸光度的纯化蛋白质。这些氨基酸残基在 280nm 处具有特征性的紫外吸收峰，使得可以通过测量该波长下的吸光度来定量蛋白质。

 

2.测量原理

基于紫外吸收光谱原理，根据样品在 280nm 处的吸光度以及蛋白质特定消光系数来计算蛋白质浓度。当一束光通过蛋白质溶液时，其中的氨基酸残基会吸收特定波长的光，吸光度与蛋白质浓度和消光系数之间遵循比尔定律（A = εbc，其中 A 为吸光度，ε 为消光系数，b 为光程长度，c 为蛋白质浓度）。通过准确测量吸光度，并已知蛋白质的消光系数，就可以计算出蛋白质的浓度。

（2）操作流程

1.仪器准备与校准

首先，选择 A280 波长，准备测量蛋白浓度。使用纯水或缓冲液清洁 NanoDrop 的上样区域，确保测量环境干净。进行空白校准，将少量（与待测样品相同体积）纯水或缓冲液放置到 NanoDrop 测量孔上，关闭仪器盖子。在仪器软件中选择蛋白质浓度的测量模式，点击测量按钮开始进行 blank 校准，等待校准完成。校准过程中，仪器会测量空白样品的吸光度，并以此为基准来校正后续样品测量中的背景干扰。

2.样品测量

校准完成后，移除 blank 样品并再次清洁测量孔及盖片。取少量（通常约为 1 - 2 微升）待测的蛋白质样品加到 NanoDrop 测量孔上，关闭仪器盖子，将测量盖片放置到仪器的测量孔中。点击测量按钮开始测量，此时仪器会发射 280nm 波长的光穿过样品，并检测样品对光的吸收程度。等待测量完成后，仪器软件会根据预先设定的计算方法（基于比尔定律和蛋白质消光系数）自动计算并显示蛋白质浓度，同时还会给出吸光度值等相关数据。读取和记录测量结果，以便后续实验分析使用。

（3）直接测量法的优势与局限性

1.优势

快速简便：整个测量过程无需额外的试剂或复杂的反应步骤，直接测量吸光度即可得出结果，大大节省了时间。而且操作流程相对简单，即使是初学者也能快速上手。

样品量少：仅需 1 - 2 微升的样品，对于珍贵或难以获取大量样品的蛋白质研究尤为重要，最大限度地减少了样品的消耗。

2.局限性

对蛋白质纯度要求较高：该方法只适用于纯化蛋白质，因为杂质（如核酸、其他小分子等）可能在 280nm 处有吸光，干扰蛋白质浓度的准确测量。

受蛋白质组成影响：不同蛋白质中 Trp 和 Tyr 残基的含量不同，导致消光系数存在差异。如果使用错误的消光系数，会得出不准确的浓度结果。因此，需要准确了解所测蛋白质的消光系数，对于未知蛋白质可能需要进一步的分析和鉴定。

 

三、NanoDrop 的间接比色测量法

（1）与直接测量法的区别

间接比色测量法与蛋白质 A280 直接测量法不同，它们需要通过化学反应使蛋白质与特定试剂反应生成有色产物，然后测量有色产物在特定波长下的吸光度，并通过与标准曲线比较来定量蛋白质浓度。这意味着需要额外的试剂、更长的操作时间以及预先制作标准曲线。

（2）操作要点（以制作标准曲线为例）

1.标准品选择与稀释

首先要选择合适的蛋白质标准品，如牛血清白蛋白（BSA）等。根据所选测量方法（如 BCA 法、Bradford 法等）的线性范围，准确配制一系列不同浓度的标准品溶液。例如，对于 BCA 法，可能需要配制浓度范围为 200 - 8000μg/mL 的 BSA 标准品溶液。

2.反应与测量

将标准品溶液与相应的试剂按照规定比例混合，在特定温度和时间条件下进行反应。反应完成后，将反应产物转移至 NanoDrop 分光光度计中，选择合适的测量波长（如 BCA 法为 562nm，Bradford 法为 595nm 等），测量吸光度。

3.标准曲线绘制与样品测量

根据测量得到的标准品吸光度值，以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。标准曲线应具有良好的线性关系（相关系数 R2 接近 1）。对于待测样品，按照相同的反应条件进行处理，测量其吸光度，然后根据标准曲线计算出蛋白质浓度。

 

（3）不同比色测量法的特点

1.BCA 法

特点：在蛋白质存在下，Cu2 + 被还原为 Cu+，Cu + 与 BCA 试剂形成紫色络合物，在 562nm 处有吸收峰。该方法对大多数表面活性剂（浓度高达 5%）兼容，且蛋白质间差异相对较小，常用于稀释度更高的样品。但还原剂、铜整合剂和高容量缓冲液会干扰检测。

2.Bradford 法

特点：考马斯亮蓝 G - 250 与蛋白质结合后颜色从红色变为蓝色，在 595nm 处测量吸光度。操作简便快速，可在室温下进行检测。然而，其线性范围相对较窄，表面活性剂可能导致试剂沉淀，蛋白质间变异性较大。

3.Lowry 法

特点：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与硫酸铜 - 酒石酸盐配合物反应生成蓝色复合物，在 650nm（或改良型 Lowry 在 650 - 750nm）处测量吸光度。该方法需要注意钾离子、去污剂、整合剂、还原剂和游离硫醇等干扰因素，这些物质可能沉淀试剂或干扰测定。

4.Pierce 660 法

特点：准确、快速且简单的比色检测，与大多数去污剂、还原剂和 Laemmli 上样缓冲液兼容，在室温下检测且孵育时间短，试剂室温储存。与 Bradford 法相比，扩大了标准曲线的线性范围，蛋白质间差异更小。

 

四、方法选择与实验注意事项

（1）方法选择依据

1.样品特性

如果是纯化的含有 Trp 和 Tyr 残基的蛋白质，且对速度和样品量有要求，蛋白质 A280 直接测量法可能是较好的选择。对于成分复杂、可能存在杂质干扰的样品，或者需要更高准确性和更广泛适用性的情况，间接比色测量法可能更为合适，其中不同的比色法又可根据具体实验条件（如是否存在特定干扰物质、对线性范围的要求等）进一步选择。

2.实验目的与要求

若实验仅需快速初步估计蛋白质浓度，且对准确性要求不是极高，蛋白质 A280 直接测量法或 Bradford 法等操作简便的方法可满足需求。但对于需要精确测定蛋白质浓度的实验，如蛋白质定量用于药物研发、酶活性研究等，BCA 法或 Pierce 660 法等准确性更高、蛋白质间差异更小的方法可能更为适用。

（2）实验注意事项

1.仪器维护与校准

定期清洁 NanoDrop 的测量孔、光学元件等部件，确保仪器光路畅通，测量准确。按照仪器说明书的要求进行定期校准，包括波长校准、吸光度准确性校准等，以保证测量结果的可靠性。

2.样品处理与操作规范

样品应尽量避免杂质污染，对于直接测量法，确保蛋白质样品的纯度符合要求。在进行间接比色测量时，准确配制试剂，严格控制反应条件（温度、时间、试剂比例等），避免操作误差导致标准曲线不准确或样品测量结果偏差。同时，注意样品和试剂的保存条件，防止变质影响测量结果。