IHC（免疫组化）是一种检测生物组织中蛋白质的方法，常用于癌症和其他疾病的诊断。在IHC过程中，可能会遇到背景染色、非特异性染色和假阳性等问题。

要解决这些问题，可以优化抗体浓度、缓冲液pH值和染色时间。

一、片子为弱阳性，甚至完全没有染色

1.一二抗不匹配，例如，一抗为兔抗，二抗却使用了抗鼠的抗体，导致染色为阴性
使用针对一抗来源的种属产生的二抗，同时要确保一抗和二抗的同种型匹配

2.抗体浓度不足，导致结合到蛋白的一抗不足
提高抗体浓度以及孵育时间，4℃过夜孵育可以得到较好的效果

3.抗体未经过验证，无法结合具有天然构象的蛋白质
更换经过验证的抗体，或是进行非变性电泳确认抗体的效价是否正常

4.目标检测蛋白在组织中表达量比较低或是根本不表达
在进行实验之前确认蛋白表达量，引入阳性样本作为对照，或者使用信号放大技术，让结果更加清晰

5.未进行抗原修复，导致抗原识别表位改变
使用不同的抗原修复方法来使表位暴露，包括用pH6或pH9缓冲液的热抗原修复法、酶抗原修复法等，或者尝试使用交联固定剂而不是有机（醇类）固定剂，防止抗原扩散

6.核内表达的蛋白无法与抗体结合
引入通透步骤，向封闭缓冲液和抗体稀释缓冲液中加入强透化剂，例如Triton X，帮助抗体与目标蛋白结合

7.实验试剂污染，导致蛋白上的抗体识别位点被破坏，从而产生阴性结果
使用新配的实验试剂并进行完全的灭菌处理或将缓冲液中加入0.01%=叠氮化物

8.靶蛋白为膜蛋白而表位可能因为渗透作用被破坏或移除
将缓冲液中的渗透试剂减少或移除

二、片子背景较深，特异性不好

1.封闭时间过短，抗体与背景非特异性结合
可以通过更换封闭剂或延长封闭时间来优化试验结果，常用封闭条件为：使用5%BSA封闭样本30分钟，使用与二抗种属来源相同的10%血清封闭也是可取的

2.一抗浓度过高导致背景与过多的一抗结合，产生非特异性染色
降低一抗浓度，在正式实验前进行预实验确定稀释比例

3.孵育温度过高，孵育时间过长，导致非特异性结合增加
最好低温4℃过夜孵育一抗，效果较好

4.内源性过氧化物酶未去除，组织中的红细胞、 粒细胞干扰了染色结果的判断
为了消除内源性过氧化物酶，通常采用的方法是3%过氧化氢处理10min。‌这种方法在免疫组化实验中常用，可以有效去除组织中的内源性过氧化物酶，从而避免对实验结果的干扰‌

5.一抗的种属来源与组织样本的种属相同
使用种属来源不同于样本种属的一抗。或检测系统使用生物素直标一抗和酶偶联的链霉亲和素

6.二抗产生的非特异性结合
单独孵育二抗确认非特异性染色的情况，如果真的有非特异性染色，则需要更换二抗

三、抗原定位不准确

1.抗原在组织中的分布不均
优化抗原修复，对组织进行适当的抗原修复，以暴露抗原并提高抗体的识别能力

2.抗体的识别能力不足
选择针对目标抗原具有高亲和力的抗体，以提高抗原识别的准确性
在实验中增加阳性对照，以验证抗体的识别能力和实验结果的可靠性

3.抗原修复过强，导致组织结构被破坏，蛋白转移
优化抗原修复程序或尝试不同的抗原修复方法，注意保留组织完整形态
根据组织大小，提高固定剂与组织的比例，切取小组织块，浸泡固定更加充分

4.制备切片时操作不规范
使用新鲜组织切片，并将切片妥善保存

四、染色不均

1.组织固定不充分，一般是边缘染色较深，内部染色较浅，或是胞质胞核对比不鲜明
组织切开后固定效果好，以10%中性福尔马林固定4-24h，注意固定的时间较长会影响抗原决定簇的暴露，导致结果出现阴性
固定液体积要超过组织体积5倍以上，量少应中途换液1-3次

2.切片厚度不一致
需更换刀片，调整切片机状态

3.试剂配制未混匀，导致局部浓度不一致
将试剂充分混匀后滴加，在滴加试剂时让试剂全覆盖组织

五、脱片

1.脱蜡时间过长，导致组织发硬发脆
二甲本脱蜡时间不宜长，1-3h最佳，同时梯度酒精脱水尽量底充分

2.切片太厚，导致效果不好并脱片
切片角度和刀片新旧程度对切片效果的影响较大，切片角度视切片机型号而异，新刀片更易切出完好的切片
切片厚度视组织而定，太厚易导致细胞重叠，影响观察
粘片时玻片可用多聚赖氨酸或蛋白甘油处理，或选择防脱片，以增强粘附性