抗原、血清、碳酸盐包被缓冲液、PBST

BSA、96 孔酶标板、4 ℃ 冰箱

恒温培养箱、分光光度计

一、包被抗原

1. 用 50 mM 的碳酸盐包被缓冲液（pH 9.6）溶解抗原，使抗原浓度为 10～20 μg/ml，加 100 μl/孔到 96 孔酶标板，4 ℃ 放置过夜。

2. 第二天弃去包被液后，用 PBST 洗涤 3 次，每孔加入 150 μl 1% BSA 37 ℃ 封闭 1 小时。

3. PBST 洗涤 3 次后，每孔加入 100 μl 不同倍比稀释度的血清，并加入对照样品，37 ℃ 孵育 2 小时。

4. PBST 洗涤 5 次后，加入 100 μl 稀释后的 HRP 标记的二抗，37 ℃ 孵育 1 小时。

5. PBST 洗涤 5 次后，显色剂显色 20 min 后，酶标仪上读取 A405 吸收值。

二、包被细胞

1. 在 96 孔培养板上接种细胞数为 1 x 104 cells/well，37 ℃ 过夜培养。

2. 第二天用 PBS 洗涤培养板 2～3 次。

3. 加入 125 μl/well 10% Forma lin（1:10 稀释）， 室温下固定 15 min。

4. 用 ddH2O 洗涤培养板 3 次，并晾干，储藏在 2～8℃ 备用。

5. 用 PBST 洗涤 3 次，每孔加入 150 μl 1% BSA 37 ℃ 封闭 1 小时。

6. PBST 洗涤 3 次后，每孔加入 100 μl 不同倍比稀释度的血清，并加入对照样品，37 ℃ 孵育 2 小时。

7. PBST 洗涤 5 次后，加入 100 μl 稀释后的 HRP 标记的二抗，37 ℃ 孵育 1 小时。

8. PBST 洗涤 5 次后，显色剂显色 20 min 后，酶标仪上读取 A405 吸收值。

50 mM 的碳酸盐包被缓冲液：Na2CO3 0.15 克, NaHCO3 0.293 克， 蒸馏水稀释至 100 m，调节 pH 为 9.6，4 ℃，保存。

ABTS 作为底物进行显色反应 （10 ml） ：0.2 M Na2HPO4 2.4 ml 0.1 M 柠檬酸 2.6 ml ddH2O 5 ml ABTS 5 mg H2O2 （30%） 4 ul（用前加入）。

三、注意事项

血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性 HRP，也会产生假阳性反应。如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法 ELISA 中可使本底加深。
一般说来，在 5 天内测定的血清标本可放置于 4 ℃，超过一周测定的需低温冰存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和，不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。
反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂。

四、常见问题

按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA 中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用 pH 计测量较正。
从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。