62℃烘箱烘片2小时,进行常规脱腊之水。
下面开始IHC实验。
将内源性过氧化物酶滴在组织上,放入37℃烘箱孵育7-8分钟,取出湿盒,PBS洗3次,每次5分钟。
准备好两缸柠檬酸钠,一缸用来后续补加,将染色架放入柠檬酸钠浸泡,将切片盒放入微波炉中,设置P100,1次5分钟,P80 3-4次各5分钟,加热期间需要观察水分是否有损失,如果低于载玻片就要加入修复液,结束后放置于试验台上冷却至室温,冷却完后用PBS洗3次,每次5分钟,之后擦拭掉多余的PBS,在切片上画圈,放置试剂留出。
下面进行5%BSA配置,称量0.5g牛血清白蛋白,加入10毫升PBS,震荡混匀得到5%BSA,滴加5%BSA,放入37℃烘箱中40分钟,用5%BSA稀释得到1%BSA,配置一抗,配置二抗,40分钟后将湿盒从烘箱取出,用纸吸走BSA,滴加一抗,放湿盒中4℃冰箱孵育过夜。
第二天取出湿盒,回收一抗,浸泡PBS2次,10分钟后擦拭掉多余水分,滴加二抗,放入37℃烘箱孵育1小时,孵育完成后用PBS洗3次,每次5分钟,擦干组织周围的PBS,滴加DAB显色剂5分钟(DAB显色剂A液:B液,1:1配置),镜下观察,控制显色时间(组织出现黄色即可)
终止反应,用PBS洗3次,每次5分钟,苏木素染色20秒,水洗2缸,返蓝液浸泡,水洗3-5min。
下面开始封片,晾干后用中性树胶封片,观察实验结果并拍照。