一、名词解释
盐溶（saltingin）
低浓度时，中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称为盐溶。是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强，因而溶解度变高。
盐析（salting out）
离子强度上升到一定水平时，蛋白质溶解度开始下降，并从水溶液中沉淀出来，这种现象称为盐析。盐析作用主要是由于大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水，从而使蛋白质从盐溶液中析出。盐析法是蛋白质分离过程中最常用的方法之一。
电泳（EP）
指带电颗粒在外电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳或离子泳。利用介质中蛋白分子所带电荷、分子大小、形状不同而使蛋白分子在电泳体系中向不同方向以不同速率移动，进而达到分离的技术称为电泳技术。目前使用最广泛的区带电泳是凝胶电泳，它最常用的支持介质有聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。
等电聚焦电泳（IEF，isoelectric focusing）
等电聚焦电泳（IEF）也称电聚焦电泳，是一种高分辨率的蛋白质分离技术，它主要用于蛋白质等电点的测定。利用特殊的一种缓冲液（两性电解质）在聚丙烯酰胺凝胶内制造一个pH梯度，电泳时每种蛋白质就将迁移到它的等电点（pI）处的蛋白质分离技术。即蛋白质到达梯度中的某一pH时，就不再带有净的正或负电荷了。现在多用的凝胶介质是聚丙烯酰胺、琼脂糖和葡聚糖凝胶等。
双向电泳（two-dimensinal electrophoresis）
指等电聚焦（IEF）和随后的SDS-PAGE相结合的分离技术。蛋白质在薄胶条上用IEF进行第一次分离，再把胶条水平向铺设在PAGE上用SDS-PAGE进行第二次分离。得到的双向电泳谱上水平向分离反映pI的差别，垂直向分离反映分子质量的差别。可分离分子质量相近而pI不同或pI相近而分子质量不同的蛋白分子。
层析（chromatograpHy）
层析是“色层分析”的简称。利用各组分物理性质的不同，将多组分混合物进行分离及测定的方法。层析也称为色谱，是一种分离和分析方法，基本原理是基于氨基酸的溶解度性质。有吸附层析、分配层析两种。一般用于有机化合物、金属离子、氨基酸等的分析。层析对生物大分子如蛋白质和核酸等复杂的有机物的混合物的分离分析有极高的分辨力。
亲和层析（affinity chromatograpHy）
利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其它分子的层析技术，是一种利用蛋白质分子对其配体分子具有专一性的识别能力或称为生物学亲和力建立起来的一种纯化方法。亲和层析的优点：只需要一步处理就可以将很少的蛋白质分离出来；还可以将失活的杂质去除。例如，凝集素亲和层析、免疫亲和层析和金属螯合层析等等。
疏水作用层析（hydropHobic interaction chromatograpHy）
指根据蛋白表面疏水性的不同，利用蛋白和疏水层析介质疏水表面的可逆相互作用来分离蛋白的方法。疏水层析要求高盐浓度的存在以促进蛋白质分子表面的疏水区暴露，为了使吸附达到最大，可将蛋白质样品的pH调节到等电点附近，蛋白质吸附后，可以采用逐渐降低离子强度或增加pH的洗脱液进行洗脱。
透析（dialysis）
利用蛋白分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖等分开。常用的半透膜是玻璃纸等纤维素材料。透析的过程：将待纯化蛋白溶液装在含半透膜的透析袋里，放入透析液（蒸馏水或缓冲液）中，透析液可更换至透析袋内小分子物质浓度降到最少为止。
超过滤或超滤（ultrafiltration）
利用压力或离心力强行使水和其他小分子物质通过半透膜而蛋白质被截留在膜上以达到浓缩和脱盐的目的。在超滤过程中容易出现膜堵塞的问题，通常采用切向流过滤，即：液体在泵驱动下沿与膜表面相切的方向流动，使部分液体透过膜而另一部分液体切向流过膜表面，将被膜截留的蛋白分子冲走（反流回样品槽），从而避免膜堵塞。
凝胶过滤（gel filtration）
凝胶过滤又称大小排阻层析、分子筛。根据多孔介质对不同大小和形状分子的排阻能力不同而分离蛋白混合物。当分子大小和形状不同的蛋白分子流经凝胶层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶珠而被排阻在外，流动的距离最短；反之，比凝胶孔径小的分子流动距离长，因此，不同大小的分子由于所经的路线不同而得到分离。
密度梯度（区带）离心
蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，则停滞不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成各自独立的区带，分成区带的蛋白质可以在管底刺一个小孔，逐滴放出，分步收集，这种方法称为密度梯度（区带）离心。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）以聚丙烯酰胺作为支持介质，聚丙烯酰胺兼有分子筛效应，因此聚丙烯酰胺凝胶电泳根据被分离物质的相对分子质量和带电荷多少来分离物质。因为支持物的孔径比较小，可用来分析分子质量较小的DNA或RNA样品。在变性条件下进行凝胶电泳，其电泳迁移率与单链Mr的对数呈理想的反比关系（变性电泳）
二、问答题
试述分离、纯化蛋白质的一般原理和方法。
（1）分离、纯化蛋白质的一般原理：蛋白质由氨基酸构成，一部分性质与氨基酸相同，如两性解离和等电点、某些呈色反应等。但蛋白质是由氨基酸借肽键构成的高分子化合物，又有不同于氨基酸的性质，易沉降，不易透过半透膜，变性，沉淀凝固等。通常可利用蛋白质的理化性质和生物学性质来分离、纯化蛋白质。
（2）蛋白质分离、纯化的方法：
a.等电沉淀：某种蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于这种蛋白质分子之间没有净电斥力而趋于聚集沉淀。因此在其他条件相同时，它的溶解度达到最低点。当pH被调至混合蛋白质中某一成分的等电pH时，这种蛋白质的大部分或全部将沉淀下来，那些等电点不在此pH的蛋白质则仍留在溶液中。这样沉淀出来的蛋白质保持着天然构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。
b.盐析：离子强度上升到一定水平时，蛋白质溶解度开始下降，并从水溶液中沉淀出来，这种现象称为盐析。盐析作用主要是由于大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。此时那些被迫与蛋白质分子表面的疏水基团接触并掩盖它们的水分子变成盐离子的水化水，留下暴露出来的疏水基团。
c.有机溶剂分离：与水互溶的有机溶剂（如甲醇、乙醇和丙酮等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之一是改变了介电常数。
d.透析与超滤：透析是利用蛋白分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖等分开。过程：将待纯化蛋白溶液装在半透膜的透析袋里，放入透析液（蒸馏水或缓冲液）中，透析液可更换至透析袋内小分子物质浓度降到最少为止。超滤是利用压力或离心力强行使水和其他小分子物质通过半透膜而蛋白质被截留在膜上以达到浓缩和脱盐的目的。若滤膜选择得当，还可同时进行粗分级。
e.密度梯度离心：蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，则停滞不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成各自独立的区带，分成区带的蛋白质可以在管底刺一个小孔，逐滴放出，分步收集。
f.凝胶过滤——大小排阻层析：根据多孔介质对不同大小和形状分子的排阻能力不同而分离蛋白混合物。
g.凝胶电泳：最常用的支持介质有聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。凝胶电泳在用缓冲液配制的支持介质上进行。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）适于分离蛋白质和寡核苷酸，琼脂糖凝胶电泳多用于核酸的分离。
h.等电聚焦和双向电泳：等电聚焦（IEF）也称电聚焦，是一种高分辨率的蛋白质分离技术，它主要用于蛋白质等电点的测定。等电聚焦是在具有pH梯度的介质中进行的。现在多用的凝胶介质是聚丙烯酰胺、琼脂糖和葡聚糖凝胶等。双向电泳用于分离多种蛋白质中有相对分子质量接近的和等电点接近的情况
i.离子交换层析：根据在给定pH下蛋白净电荷符号和数量不同进行分离的层析方法。它以离子交换剂为固定相，蛋白分子对离子交换剂的结合力取决于互相之间相反电荷基团的静电相互作用，两者的电离程度取决于溶液pH。
j.疏水相互作用层析：指根据蛋白表面疏水性的不同，利用蛋白和疏水层析介质疏水表面的可逆相互作用来分离蛋白的方法。
k.亲和层析：指根据蛋白分子对其配体分子特有的生物学亲和力建立的层析方法。优点：只需要一步处理就可以将很少的蛋白质分离出来；还可以将失活的杂质去除。
l.高效液相层析（HPLC）：是离子交换、分子排阻、吸附和分配等层析技术的发展新阶段。
凝胶过滤层析和凝胶电泳中的分子筛效应有什么不同？为什么？
凝胶过滤层析和凝胶电泳是进行蛋白质分离的两个方法。
（1）凝胶过滤层析的原理： 凝胶过滤又称大小排阻层析、分子筛。根据多孔介质对不同大小和形状分子的排阻能力不同而分离蛋白混合物。常用的凝胶有交联葡萄糖，聚丙烯酰胺凝胶等。当不同大小的蛋白质分子流经凝胶装成的层析柱时，相对分子质量较大的蛋白质不能进入凝胶珠而被排阻在外，随溶剂通过凝胶珠之间的空隙先流出柱外，而相对分子质量较小的蛋白质则进入凝胶珠，后流出柱外。不同大小和形状的分子在多孔介质中受到的排阻能力不同借此可分离蛋白质混合物。
（2）凝胶电泳原理： 以凝胶为支持物，制成凝胶柱或凝胶板。凝胶是由相连的两部分（浓缩胶和分离胶）组成，电泳时样品首先在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带，然后再进行电泳分离。根据蛋白质等大分子的电泳迁移率（即分析物向相反电荷的电极移动的能力）来分离它们。在凝胶电泳中，这由分子的电荷、大小（分子量）和形状决定，分析物通过凝胶中形成的孔隙移动。
（3）二者区别：
①凝胶层析不需要进行电泳，只需要在凝胶层析柱中进行，而凝胶电泳需要在缓冲液中进行电泳。
②凝胶层析分离蛋白质仅仅和分子大小与形状有关，大分子物质先被洗脱出来，小分子物质后被洗脱出来，对于分子量相同的蛋白质，线型分子在前，球状分子在后；凝胶电泳不仅和分子大小与形状有关，还与分子所带电荷有关。
