Western blot(蛋白印迹)作为科研研究中最为平常的实验，却蕴含了很多知识，可谓是小实验里却有大文章。尽管绝大多数研究僧都会被WB实验虐得生无可恋，却也在和WB斗志斗勇的过程中积累了不少经验。

一、蛋白样品制备是实验成功的一半

 

 

经验总结：

1. 合适的盐浓度下，保持蛋白质的最大溶解性和可重复性；

2. 尽量除去核酸，多糖，脂类等干扰分子；

3. 蛋白质的提取要在低温环境下进行，以抑制蛋白酶的水解作用（可加入适合的蛋白酶抑制剂）；

4. 蛋白样品建议分装后千万不要反复冻融，可冷冻干燥或直接以液态置-80℃中保存；

5. 蛋白浓度低时，可使用超滤膜浓缩或者用真空冻干机将蛋白冻干。

 

二、 电泳是实验的关键

 

经验总结：

1. 上样时，根据蛋白表达丰度调整蛋白上样量，尽量每孔上样量保持一致；

2. 胶最好现配现用，如果需要保存，要用湿润的保鲜膜包好并置于4℃冰箱中；

3. 为了检测整个实验系统或校准实验结果，需要设置内参，内参一般指由管家基因编码表达的蛋白；

4.为了确保western blot结果的准确性和特异性，必须要设置合理的对照，一般需要设置的对照如下——

阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率；

阴性对照：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性；

二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性；

内参对照：检测标本的质量和二抗系统；

空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果。

 

三、转膜，最后能不能出条带全靠你

转膜方法有两种湿转法和半干法

经验总结：

1. 胶在负极，膜靠近正极；

2. 夹好膜和凝胶后，确保凝胶、膜和滤纸之间无气泡，否则会导致转膜不完全；

3. 注意一定要戴手套或塑料镊子接触膜，避免手上的蛋白和油脂降低转膜效率；

4. 转膜过程中，尤其是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中；

5. 对于湿转法：一般转膜的电流在200mA-400mA之间，转膜时间为30-60分钟。片段>50KD的可以选用350mA，小片段的可以用250mA。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。

 

四、免疫印迹，见证结果的时刻

经验总结：

1.常见的封闭液有5%脱脂奶粉、BSA和Western Blot膜封闭液（生物试剂公司提供）。但是封闭液的选取具体得看抗体说明书，有的抗体只能用BSA。此外封闭液浓度的选择也是看抗体的要求，一般情况5%BSA会比5%脱脂牛奶的效果好；

2.选择抗体时，一方面需要考虑所选抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一方面需要考虑所选抗体是否会引起交叉反应条带。

 

五、WB疑难杂症

 

经验总结：

1.条带笑了，我哭了……

可能原因：凝胶聚合不均匀，灌胶时要混合均匀，动作轻缓。

2.背景太深，都是黑黢黢的……

可能原因：膜或者缓冲液被污染；封闭不充分；检测时曝光时间过长；抗体浓度过高或者抗体与封闭液之间有交叉反应。

3.条带信号很弱

可能原因：洗膜过度；抗体保存不当或蛋白含量太低不充足。

4.出现特异条带

可能原因：一抗不是唯一特异的或者二抗出现非特异结合。

5.目标带是空白，周围有背景

可能原因：一抗浓度较高，二抗HRP催化活力太强，同时显色底物处于一个临界点，反应时间不长，将周围底物催化完，形成了空白即“反亮现象”。