免疫荧光技术是标记免疫技术中发展最早的一种,是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术,包括荧光抗体法和荧光抗原法,但在实际工作中荧光抗原技术应用较少。
细胞免疫荧光染色是免疫荧光技术在细胞中的应用。
01 技术特点
优点:特异性强、敏感性高、速度快。
缺点:非特异性染色问题尚未完全解决,结果判定的客观性不足,技术程序也还比较复杂。
02 免疫荧光染色原理
主要原理:利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白。
主要包括蛋白和一抗结合;其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗,荧光显微镜下即可观察到荧光。
03 简单的细胞免疫荧光实验步骤
1.漂洗血清蛋白pH7.2-7.4,37℃,PBS,2h;
2.零下20℃甲醇固定20min后,自然干燥10min;
3.PBS洗净:3min,3次;
4.1%Triton:25min-30min,配成50ul triton+5ml PBS;
5.PBS洗净:2次,5min;
6.羊血清封闭:37℃,20min;
7.一抗,4℃过夜,一般要>18h或37℃,1-2h;
8.4℃,PBS洗净,3min,5次;
9.二抗,37℃,<1h;
10.37℃,PBS洗净,3次,5min;
11.晾干封片(封闭液pH8.5)。
注意:
不管采用何种方法,在使用PBS缓冲液漂洗时,都要漂洗干净并且要测下pH值,可以使用PBS多清洗几次,也可以延长PBS清洗时间,如果结果背景较高可以延长漂洗的次数和时间。
04 zo-1的免疫荧光染色实验步骤
1.细胞在盖片上生长融合到95%-100%时,从孵箱中取出;
2.用预温的1×PBS洗三次,每次10min;
3.4%的甲醛室温固定20-30min;
4.1×PBS洗3次,每次10min;
5.0.2%Triton X-100透化2-5min;
6.1×PBS洗3次,每次10min;
7.5%BSA室温封闭30min;
8.加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里,4℃过夜
9.1×PBS洗3次,每次10min;
10.加二抗(用1%BSA稀释)30min,闭光;
11.1×PBS洗3次,每次10min;
12.95%甘油封片。
注:4%甲醛,0.2%Triton,5%BSA均用1×PBS稀释。
05 细胞爬片的免疫荧光实验步骤
1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里,PBS洗三遍;
注意:
a.有时候细胞爬片可能较小,因此夹取时要小心,注意反正面,放在皿里洗比较方便,避免来回夹取;
b.洗的时候加PBS不要太冲,不要把细胞冲下来,可以尝试一下洗的时候多加PBS,稍晃一下就倒掉,不等5min或10min。
2.4%冷的多聚甲醛固定20min,PBS洗三遍;
3.0.2%Triton X-100通透10min,PBS洗三遍;
4.与二抗相同宿主的血清封闭30min,PBS洗三遍;
5.一抗4℃湿盒内过夜或37℃,2h(前者效果可能好一些),PBS洗三遍;
6.二抗室温2h(避光),或者37℃,1.5h,PBS洗三遍;
7.最好用DAPI染核,然后直接照荧光片;
8.蒸馏水洗掉PBS,用甘油封片,指甲油封片子的四周,因为甘油不像树脂那样会干,所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。
建议:
a.染完之后没有封片之前直接照一部分,因为有的时候可能封片会出问题,再想照反而没有了,另外不要拖太长时间,荧光会淬灭。
b.荧光的片子一定要避光保存,若保存得当,过一段时间仍然能照出很好的片子。
c.二抗用之前一定要离心,不然可能有沉淀,在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点,非常难看。
06 常见荧光染料
1.异硫氰酸(FITC):绿色530nm;
2.藻红蛋白(PE):橙黄色575nm;
3.多甲藻黄素叶绿素蛋白(PerCP):深红色675nm;
4.碘化丙啶(PI):橙红色620nm,488nm波长的氩离子激光激发;
5.别藻青蛋白(APC):红色660nm,630nm波长的氦氖激光或红色二极管激光激发;
6.Cy3:激发波长488nm,最大发射波长570nm;
7.Cy5:激发波长633/635nm,最大发射波长670nm。
信号弱或无信号
靶标蛋白丰度低
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查阅参考文献,核实待检细胞是否表达目的蛋白以及靶标蛋白的表达丰度
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通过Western-blot验证靶标蛋白是否在样品中表达及表达丰度
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建议使用间接免疫荧光检测,以放大信号
靶标蛋白在胞内
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甲醇和丙酮固定可透化细胞
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甲醛固定,需尝试不同百分比的 Triton X-100 (0.1-0.25%)或Tween-20透化细胞
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适当延长通透时间
固定方法不当,破坏靶标蛋白的抗原表位
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更换固定液,优化固定时间
抗体不适用ICC/IF
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查看抗体说明书,抗体是否经ICC/IF实验验证
抗体浓度过低
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增加一抗/二抗的工作浓度,或者通过梯度稀释确定抗体最佳稀释度
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建议4℃过夜孵育
一抗与二抗不匹配
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确保使用针对一抗物种产生的二抗
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确保二抗针对的同种型与一抗同种型相匹配
荧光信号淬灭
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避光条件下孵育荧光抗体
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样品封片时加入抗淬灭试剂
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建议封片后立即进行成像
荧光显微镜通道选择不合适
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确保选择的荧光团激发/发射波长与检测通道相匹配
样品的储存时间过长
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使用新鲜制备的样品,避免抗原被破坏
一抗不与靶标蛋白结合
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使用经验证适用于检测靶标蛋白的一抗
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设置阳性对照(例如,过表达靶标蛋白的细胞)检测抗体功能
免疫荧光中整个细胞片都出现荧光亮点(如图2),一般是由于样本、器皿、成像介质的自发荧光或荧光染料非特异性结合造成的高背景。这时我们可以从以下几点排查:
高背景
封闭不充分或封闭液不合适
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适当延长封闭时间
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更换封闭剂,推荐使用二抗宿主来源的血清进行封闭
抗体浓度过高
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适当降低抗体浓度,或者通过梯度稀释确定抗体最佳稀释度
二抗非特异性吸附
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设置不孵一抗、只孵二抗的阴性对照
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建议使用预吸附二抗
洗涤不充分
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在洗涤液中加入tween20,并适当增加洗涤时间和洗涤次数
自发荧光
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设置未染色的样品为阴性对照,检测自发荧光
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封闭液中添加终浓度为0.3mol/L甘氨酸或使用非醛类固定液
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细胞自发荧光在蓝色波长中高,避免对低丰度靶标蛋白使用蓝色荧光抗体
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旧甲醛溶液易产生自发荧光,更换新鲜配制的甲醛固定液
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固定后,样本充分洗涤,去除固定液残留
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更换自发荧光低的器皿
信号强度低,产生背景噪音
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优化信噪比,使用更亮的荧光素进行检测
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实验允许情况下,增加靶标蛋白表达量(过表达或诱导剂)
样本变干
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在湿盒中孵育抗体,避免样本干燥
一抗非特异性结合
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使用经实验验证适用于细胞样品免疫荧光的一抗
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使用与样本物种不同种属来源的抗体
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设置敲除/敲低靶标蛋白的阴性对照
光谱重叠(多色实验)
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调整显微镜设置,一次只接收一个荧光素信号
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尽量选择没有光谱重叠的荧光素